Francisellose – et hinder ved oppdrett av torsk
Makrofager er viktige immunceller i førstelinjeforsvaret hos vertebrater og de er designet til å drepe invaderende mikrober. Bakterier i slekten Francisella er kjent for å kunne formere seg i nettopp disse cellene og makrofagene fungerer derfor som «trojanske hester» hvor fiender smugles inn. Francisellose
har skapt store økonomiske tap ved oppdrett av torsk grunnet mangelen på både vaksine og behandling. Fokuset i avhandlingen har vært å studere interaksjoner mellom verten og bakterien som forårsaker sykdommen. Infeksjon av torskeceller, makrofager fra hodenyre og en torskecellelinje, i tillegg til levende torsk ble utført for å studere hvordan bakterien påvirker verten. Vi ønsket blant annet å finne svar på om de overlever og formerer seg i begge celletypene og hvor bakteriene er lokalisert inne i makrofagene. Videre ble viktige immungener studert under en infeksjon.
Vi fant ut at bakterien er i stand til å overleve og vokse i både torskemakrofager og torskecellelinjen. Inne i makrofagene skiller bakterien ut vesikler, ødelegger membranen de er omsluttet i den intracellulære vakuolen og rømmer ut til cytosol hvor de formerer seg. Dette kan gi svar på hvilken del av immunsystemet som er viktig for bekjempelse. Ved å se på uttrykk av immungener etter bakterieinfeksjon eller behandling med et endotoksin på yttermembranen av bakterien, ser det ut til at bakterien har utviklet mekanismer for å unngå vertens immunresponser. Videre ble tre typer antibakterielle proteiner, som naturlig produseres av torsk, studert og alle var viktig under infeksjon av levende fisk, men på cellenivå ser det ut til at makrofagene kun produserer den ene typen; lyzosym. Et annet viktig protein, interferon gamma (IFN-γ), viste seg å aktivere torskemakrofagene som førte til økt bekjempelse av bakteriene i cellesystemet. Proteinet kan dermed være en kandidat til hjelpestoff ved immunstimulering eller behandling av syk fisk. Prosjektet har gitt svar på viktige spørsmål ved infeksjon av bakterien og assayene som er utviklet gir verktøy for videre studier.
English summary:
SUMMARY Francisellosis has in the cod farming industry caused big economic losses because of no available vaccine or treatments. Understanding host-pathogen mechanisms is especially important when traditional vaccine strategies using inactivated bacteria are not functional. The focus of this thesis has been to study interactions between the host and the pathogen causing the disease. The bacterium Francisella noatunensis subspecies noatunensis (here after called F. noatunensis) is the causative agent and a special feature with this particular pathogen is the intracellular lifestyle and the invasion of immune cells which are designed to kill pathogens. Cod macrophages were used as tools to investigate bacterial invasion, localization of the bacterium in the host cell, survival and replication. Additionally, expression of immune and antibacterial genes was measured after infection with the bacteria. LPS from both F. noatunensis and E. coli was used as immune stimulants and activation of macrophages with gamma interferon (IFN-γ) was conducted. Investigation of invasion, survival and replication of F. noatuensis in a cod cell line of epithelial-like cells (ACL-cells) were also included. Important findings are that F. noatunensis is able to survive and replicate in both cod macrophages and ACL-cells. Inside macrophages the bacteria seems to release vesicles, disrupt the phagosomal membrane and escape into the cytosol. Pro-inflammatory responses in cod macrophages appeared to be low while an anti-inflammatory response was higher. Also F. noatunensis LPS are a poor inducer of pro-inflammatory cytokine in contrast to E.coli LPS. The low induction of inflammatory responses after F. noatunensis infection or treatment with its LPS, suggests that this bacterium may have evolved virulence mechanisms to subvert host immune responses in cod. Uptake of the pathogen in macrophages is dependent of actin filaments and temperature appears important in invasion of cod macrophages. It has become clear that fish possess a well-functioning interferon system to regulate host defence against viral infections and also intracellular bacteria. Recombinant (r) IFN-γ from cod seemed to activate cod macrophages to increased uptake of F. noatunensis followed by a reduction of intracellular bacteria. In addition, natural antibacterial peptides, produced by the organisms itself, were investigated. Lysozyme, cathelicidin and hepcidin were chosen as they are all identified in cod. Multiple goose-type (g-type) lysozyme genes have been found in cod and can be products of gene duplications. Analysis showed that cod seems to lack chichen-type lysozyme in contrast to other fish like Atlantic salmon. Investigation further revealed that all three types of the studied antibacterial peptides are involved in cod host defence mechanisms in vivo. Infection of cod macrophages (in vitro) confirms the importance of g-type lysozyme, while expression of cathelicidin and hepcidin genes was at the same level as control. Even though both hepcidin and cathelicidin have antimicrobial roles in mammalian phagocytic cells it looks like F. noatunensis does not trigger expression of these genes in cod macrophages. This could mean that other cells or systems than macrophages are causing cathelicidin and hepcidin amplification in cod. G-type lysozyme on the other hand seems important in defence mechanisms in cod macrophages and several issues indicate an intracellular role of this peptide.
Thesis:
http://munin.uit.no/bitstream/handle/10037/9973/thesis.pdf?sequence=7&isAllowed=y
Kommisjonen
Veiledere:
- Professor Børre Robertsen, NFH
- Dr. Marit Seppola, Nofima
Bedømmelseskomité:
- Førsteamanuensis Rannveig Björnsdóttir, Universitet i Akureyri, Island (1. opponent)
- Professor Kiron Viswanath, Nord Universitet, Bodø (2. opponent)
- Førsteamanuensis Ingvill Jensen, NFH (internt medlem og leder av komiteen)
Disputasen ble avholdt på engelsk og ble ledet av dekan Edel O. Elvevoll ved Fakultet for biovitenskap, fiskeri og økonomi
Personlig
Kathrine Ryvold Bakkemo, er født i 1978 og har vokst opp i Tromsø. Hun har en master i akvakultur fra 2005 og har siden jobbet som forskningstekniker på Havbruksstasjonen i Tromsø, ett år som prosjektkoordinator hos Fiskeriforskning og 7 år som forsker hos Nofima. Hennes nåværende jobb er teknisk kundeansvarlig hos PHARMAQ hvor hun har vært i to år.
